Christian Huck
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Herstellung und Optimierung von Semimicrosäulen für die Trennung von Oligonucleotiden durch Ionenpaarchromatographie
Christian Huck (Diplomarbeit 1995)
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) hat in letzter Zeit große Be-deutung in der Trennung von Biopolymeren wie Peptiden, Proteinen, Oligonucleoti-den und Nucleinsäuren erlangt. Der Trend in der HPLC-Säulentechnologie zur Micro-HPLC wird immer deutlicher.
Ziel dieser Diplomarbeit war es, anhand selbst hergestellter optimierter Semi-microsäulen neue Aspekte in die Diskussion der Chromatographie von Oligonucleo-tiden einzubringen. Dabei wurde auf die am Institut für Analytische Chemie und Ra-diochemie entwickelte Methode zur chromatographischen Trennung von Biopolyme-ren durch Ionenpaar-Chromatographie auf alkylierten, nicht porösen Poly-(Styrol/Divinylbenzol)-Teilchen (Christian Huber, „Entwicklung und Anwendung chromatographischer Analysenmethoden für Biopolymere“, Dissertation, Innsbruck, 1993) aufgebaut. Es wurde eine Methode zum Füllen von Semimicrosäulen ausge-arbeitet. Dabei hat sich herausgestellt, daß die Füllanordnung auf die Leistung einer Säule einen wesentlichen Einfluß hat. Das Volumen des Füllrohres darf nicht zu groß sein und der Füllvorgang soll möglichst rasch durchgeführt werden. Die Präparation des Säulenkopfes im Anschluß daran hat sich aufgrund der kleineren Querschnitts-fläche gegenüber einer konventionellen Säule als etwas schwieriger erwiesen. Die Herstellung der Semimicrosäulen konnte soweit optimiert werden, daß mit einer er-reichten Zahl an theoretischen Böden pro Meter von 55.000 an jene einer konventio-nellen Säule angeschlossen werden konnte. Durch Optimierung der Geräteparame-ter konnte die Auflösung noch weiter verbessert werden.
Die chromatographische Trennung von Nucleotiden brachte einige neue Erkenntnis-se. Zur Trennung von Mononucleotiden sind die nicht porösen Poly-(Styrol/Divinylbenzol)-Teilchen ungeeignet. Es empfiehlt sich die Verwendung von porösen Poly-(Styrol/Divinylbenzol)-Teilchen. Als Ionenpaarreagens hat sich Tetra-butylammoniumhydrogensulfat am geeignetsten erwiesen. Tetrabutylammonium-bromid kristallisiert binnen kürzester Zeit aus und die Apparatur muß einer speziellen Reinigung unterzogen werden. Die Elutionsreihenfolge der Mononucleotide hängt rein von der Natur der jeweiligen Base (pKa-Werte) ab. Dies gilt auch für die chroma-tographische Trennung von cyclischen Purinen. Anhand eines Oligonucleotidgrö-ßenstandards wird die um das Vier- bis Fünffache größere Empfindlichkeit von Se-mimicrosäulen gezeigt. Es wurden Versuche zur Hydrolyse eines phosphorylierten Oligonucleotidstandards durchgeführt, wobei trotz drastischer Reaktionsbedingungen kein Hydrolysat erhalten wurde.
In weiterer Folge wurde der Einfluß der Basensequenz und der Länge von
Oligonucleotiden auf die Retention untersucht. Prinzipiell hängt das Retentionsverhalten
gleichermaßen von der
Kettenlänge und von der Basensequenz ab, das heißt, daß sich diese wechselseitig
beeinflussen. Die Basen üben durch ihre Größe, ihren pKa-Werten und der Position der
freien
Aminogruppe im Purin- oder Pyrimidinring einen Einfluß auf die Elution aus.